تاثیرات افزودن مقادیر افزایش یافته اسیدهای آلی بر قابلیت رشد، خصوصیات لاشه، pH و فلور طبیعی روده، متابولیتهای پلاسما و پاسخ ایمنی در جوجههای گوشتی
روزبه فتحی۱، محمد صالح صمدی۱، علی قطبی۱، علیرضا صیداوی، Andres L. Martines Marin2
۱ دانشگاه آزاد اسلامی، واحد رشت، گروه علوم دامی
۲ دانشگاه Cordoba، گروه تولید دامی
تأثیرات افزودن مقادیر افزایشیافته اسیدهای آلی بر قابلیت رشد، خصوصیات لاشه، pH و فلور طبیعی روده، متابولیتهای پلاسما و پاسخ ایمنی در جوجههای گوشتی مورد مطالعه قرار گرفت. ۲۱۰ جوجه یک روزه ماده از نژاد Cobb 500 با یکی از درمانهای زیر مورد مطالعه قرار گرفتند (سه گروه ۱۰ پرندهای برای هر درمان). کنترل (جیره پایه بدون اسید افزوده شده)، جیره پایه با ۳/۰ و ۵/۰ درصد فرمیک اسید افزوده شده (گروه های F0.3 و F0.5)، پروپیونیک اسید (گروه های P0.3 و P0.5) و یا یک مخلوط تجاری از هر دو اسید و نمک آمونیوم آنها (گروه های S0.3 و S0.5). گروههای F0.5، P0.5 و S0.5 بهترین نتایج را در وزن بدن، ضریب تبدیل و وزن نسبی سینه و ران نشان دادند. S0.5 بیشترین وزن نسبی کبد و بالاترین تعداد لاکتوباسیل و کمترین تعداد اشرشیاکلی را داشت. پایینترین pH دوازدهه در گروه های P0.3 و P0.5 مشاهده شد. کلسیم پلاسما در گروههایی که افزودنی دریافت کرده بودند، بالاتر بود. پاسخ ایمنی به بیماری نیوکسل در گروههای F0.5، S0.3 و S0.5 پایدارتر بود. گروههایی که افزودنی دریافت کرده بودند، پاسخ بهتری به برونشیت عفونی داشتند، در حالی که پاسخ به SRBC در F0.5، P0.5 و S0.5 بالاتر بود. افزودن اسید فرمیک یا اسیدپروپیونیک ۵/۰ درصد به جیره جوجه گوشتی اثر مثبت بر قابلیت تولیدی طیور داشت، اما مخلوط هر دو اسید با نمکهایشان کارآمدتر بود. تغییر در محیط روده ناشی از افزودن ارگانیک اسیدها میتواند موجب دسترسی افزایش یافته به مواد مغذی و پاسخ ایمنی بهبود یافته میشود.
کلمات کلیدی: اسید فرمیک، اسید پروپیونیک، طیور، تولید، هضم، ایمنی
چندین ماده در سالهای اخیر با هدف یافتن جایگزین برای آنتیمیکروبهای محرک رشد مورد بررسی قرار گرفتند که قادر به حمایت از قابلیت رشد و جلوگیری از وقوع برخی بیماریها در طیور هستند (Huyghebaert et al. 2011). در بین این مواد، اسیدهای آلی و نمک آنها مورد توجه بیشتری قرار گرفتند، زیرا علاوه بر خواص ضد میکروبی، مزایایی نسبت به ویژگیهای آنتیبیوتیکها نشانداده که تولید را در طیور بالا میبرد (Dibner and Buttin 2002).
اثرات آنتیمیکروبیال اسیدهای آلی با توانایی عبور آن از غشای سلولی، جدا شدن آن در محیط آلکالینی داخل سلولی و توانایی اسیدی کردن سیتوپلاسم توضیح داده شده است. بنابراین، pH پایین در روده یا pKa بالاتر اسید کارآیی آنتیمیکروبیال اسیدهای آلی را افزایش میدهد (Van Immersal et al. 2006). برخی دیگر از اثرات توصیف شده در مورد اسیدهای آلی شامل بهبود هضم و جذب برخی مواد مغذی ناشی از pH پایینتر هضم و قابلیت حل شدن بالاتر اجزای جیره است (Brenes et al. 2003, Rafacz-Livingston et al. 2005, Ao et al, 2009). بهبود جمعیت میکروبی طبیعی در روده با کاهش چسبندگی باکتریهای پاتوژن و کمک به حفظ فلور طبیعی روده باعث بهبود شکل بافتی روده (Choct 2009) و پاسخ ایمنی بهینه میشود (Brisbin et al. 2008, Gabriel et al. 2006, Lan et al. 2005) و اثر تغذیهای مستقیم بر موکوس گوارش دارد، زیرا میتواند به عنوان منبع انرژی با قابلیت جذب سریع برای سلولهای روده عمل کند (Sakata 1987).
در سالهای اخیر، چندین محقق اثرات افزودن اسید فرمیک و اسید پروپیونیک و نمک آنها به جیره غذایی طیور گوشتی را به تنهایی (García et al. 2007, Hernández et al. 2006, Khosravi et al. 2012) یا در ترکیب (Gunal et al. 2006, Isabel and Santos 2009, Khodambashi et al. 2013) بر کارایی رشد و خصوصیات لاشه بررسی نمودهاند، اما نتایج متناقض بودهاند. به علاوه، مطالعات همزمان که اثرات این اسیدها در مقادیر مختلف را مورد مقایسه قرار دهند، نادر است. همچنین، تعداد کمی از محققین گزارشاتی مبنی بر متابولیتهای پلاسما یا پاسخ ایمنی در جوجههای گوشتی پس از افزودن این مواد ارائه دادهاند.
هدف از مطالعه حاضر، بررسی اثرات افزودن دو سطح از اسید فرمیک، اسید پروپیونیک و یک مخلوط تجاری از هر دو اسید و نمکهای آمونیوم آنها بر قابلیت رشد، خصوصیات لاشه، pH دوازدهه، فلور طبیعی روده، متابولیتهای پلاسما و پاسخ ایمنی در جوجههای گوشتی است.
مواد و روش ها
حیوانات، محل نگهداری، جیره غذایی و درمان
استفاده و مراقبت از پرندهها و کل فرآیندها در این مطالعه مورد تأیید کمیته اخلاق دانشگاه آزاد اسلامی قرار گرفته است. ۲۱۰ جوجه یک روزه ماده از نژاد Cobb 500 (Cobb-Vantress Inc., Siloam Springs, AR) خریداری شده از یک مرکز تجاری، مورد استفاده قرار گرفتند. جوجههای گوشتی در قفس های ۱×۱ متر که کف آنها با کاغذ مخصوص پوشانده شده، نگهداری شدند. هر قفس با یک دانخوری بشقابی و آبخوری دستی مجهز شد. امکانات شامل یک فضای باز مجهز به پردهها و هیترهای گازوئیلی با قابلیت تنظیم دما، مه پاش، فن و لامپهای فلورسنت است. دما روی ۳۲ درجه تنظیم شد و به تدریج به ۲۴ درجه در طی ۳ هفته کاهش یافت. غذا و آب در طی مطالعه در دسترس بود.
کل مطالعه ۴۲ روزبه طول انجامید. برنامه غذایی به این نحو بود که جوجهها تا ۷ روزگی با استارتر تغذیه شدند (دوره شروع)، پس از آن تا ۲۱ روزگی با grower تغذیه شدند (دوره رشد) و پس از آن تا پایان دوره (دوره finishing) با یک رژیم finishing تغذیه شدند. همه خوراکها بر پایه ذرت-سویا بودند و هیچ آنتیبیوتیکی به خوراک افزوده نشد. فرمول جیره بر اساس توصیههای کاتالوگ پرورش سوش کاب ۵۰۰ تنظیم شد (جدول ۱). جوجهها تحت یکی از درمانهای زیر قرار گرفتند: کنترل (جیره پایه بدون اسیدهای آلی)، همین جیره پایه همراه با ۳/۰ و ۵/۰ درصد فرمیک اسید (گروه های F0.3 و F0.5) ، ۳/۰ و ۵/۰ درصد پروپیونیک اسید ( گروه های P0.3 و P0.5) و سالگارد (S0.3 و S0.5).
سالگارد (Optivite, Worksop, UK) حاوی مخلوطی از اسید فرمیک و اسید پروپیونیک و نمکهای آمونیومی آنها است. هر گروه ۳ تکرار داشت. ۲۱ گروه ۱۰ پرندهای با هم در یک قفس بودند.
قابلیت رشد و خصوصیات لاشه
وزن بدن (BW) جوجه و مصرف غذا، هر هفته ثبت گردید و وزن افزوده شده (BWG, g/period)، دریافت غذا (F1, g/period) و ضریب تبدیل غذا (FCR, feed to gain g/g) تعیین شد. در سن ۴۲ روزگی، پس از ۴ ساعت عدم مصرف غذا برای اطمینان از خالی بودن رودهها، ۳ جوجه از هر گروه که به وزن مناسبی رسیده بودند، برای تعیین خصوصیات لاشه یوتانیزه شدند. وزن عضلات سینه و ران، بالها، کبد و صفرا و روده کوچک ثبت گردید.
شمارش میکروبی و اندازهگیری pH دوازدهه
در سن ۴۲ روزگی، ۳ جوجه در هر گروه انتخاب و یوتانایز شدند. سکوم هر جوجه یوتانایز شده سریعاً جدا و محتوای آن در یک لوله استریل جمعآوری شد. از این محتوا، رقتهای متوالی ۱۰ برابری از یک گرم نمونه در محلول بافری فسفات تهیه شد (تا ). سپس ۱۰۰ میکرولیتر از رقتهای سریالی برداشت شد و در پتریدیشهای حاوی محیط کشت ریخته شد. لاکتوباسیل در De Man، Rosoga, و Sharpe agar کشت داده شد و در ۳۷ درجه تحت شرایط بیهوازی به مدت ۷۲ ساعت کشت داده شد. اشرشیاکلی در محیط ائوزین متیلن بلوآگار کشت داده شد و تحت شرایط بیهوازی در دمای ۳۷ درجه به مدت ۴۸ ساعت انکوبه شد. واحدهای تشکیل دهنده کلونی باکتریای (CFU ) در پتریدیشها شمارش شد. شمارش به صورت log 10 CFU به ازای یک گرم نمونه گزارش شد. برای اندازهگیری pH دوازدهه، همین تعداد از حیوانات انتخاب و یوتانیزه شدند. محتوای دوازدهه به آرامی خارج شد و در ۱۰ میلی لیتر آب دیونیزه رقیق شد. سپس، pH توسط pH متر اندازه گیری شد.
جمعآوری خون و آنالیز و مطالعه پاسخ ایمنی
برای اندازهگیری متابولیتها و مواد معدنی پلاسما در سن ۴۲ روزگی، ۳ جوجه از هر گروه انتخاب شدند و نمونه خون از رگهای بال، در لوله حاوی EDTA جمع آوری شد. پس از سانتریفوژ نمونههای خونی (۳۰۰۰ دور در دقیقه به مدت ۱۰ دقیقه در دمای اتاق)، پلاسما در تیوبهای اپندورف در دمای ۲۰- درجه تا زمان ارزیابی نگهداری شد. آنالیز بیوشیمیایی مطابق پروتکلهای استاندارد کیتهای آزمایشگاهی تجاری (Pars Azmoon) انجام شد. پارامترهای اندازهگیری شده شامل گلوگز، پروتئین، آلبومین، اوریک اسید، تری گلیسیرید، کلسترول، کلسیم و فسفر بودند.
تولید آنتیبادی به آنتیژنهای مختلف در طول آزمایش اندازهگیری شد. ابتدا پرندهها بر علیه برونشیت عفونی (در ۱۴ و ۱۷ روزگی)، نیوکاسل (۹، ۲۰ و ۳۰ روزگی)، آنفولانزا (یک روزگی) و گامبورو (۱۴ و ۲۳ روزگی) واکسینه شدند. همه واکسنها از موسسه رازی تهران تهیه شدند. به علاوه، یک پرنده از هر گروه در زیر پوست سینه با ۵/۰ میلی لیتر از سوسپانسیون ۱۰٪ گلبول قرمز گوسفندی در بافر نمکی فسفات (SRBC) در سن ۲۱ و ۳۵ روزگی مورد تزریق قرار گرفت. برای اندازهگیری پاسخ آنتی بادی سیستمیک، نمونههای خونی از هر جوجه از هر گروه از رگ خونی بال در روزهای ۲۱، ۳۵ و ۴۲ روزگی (نیوکاسل)، در ۴۲ روزگی (برونشیت عفونی و گامبورو) و در ۲۸ و ۴۲ روزگی (SRBC) جمعآوری شد. پاسخ آنتیبادی به برونشیت عفونی و بیماری گامبورو توسط کیتهای تجاری الایزا اندازهگیری شد. تیتر کلی Ig و Ig G در پاسخ به SRBC توسط تست hemagglutination اندازهگیری شد. تیتر IgM به SRBC با محاسبه اختلاف بین تیتر Ig کلی و IgG تعیین شد.
نتایج و بحث
در مقایسه با گروه کنترل، BWG در گروههای F0.5، P0.3، P0.5، S0.3 و S0.5 (جدول ۲) بالاتر بود (P<0.05). به غیر از P0.3 بقیه گروهها FCR بهتری نسبت به گروه کنترل داشتند. با در نظر گرفتن خصوصیات لاشه، گروههای F0.5، P0.5، S0.3 و S0.5 نسبت به گروه کنترل BW بالاتری (P<0.05) داشتند (جدول ۲). به طور واضح، بهترین نتایج در گروههای F0.5، P0.5 و S0.5 مشاهده شد. هرچند نتایج ارائه شده در مقالات، یکسان نیستند. برخی از نویسندگان، قابلیت رشد بهبود یافتهای در جوجههای گوشتی وقتی با جیرهای که با سطوح مختلفی از اسید فرمیک و اسید پروپیونیک یا مخلوط این دو تغذیه میشوند، گزارش دادهاند ((Garcia et al, 2007K, Khodambashi et al, 2013, Paul et al, 2007. هرچند، چندین نویسنده هیچ بهبودی در ارتباط با این مواد گزارش ننمودهاند (Hernandez et al. 2006, Isabel and Santos 2009, Khosravi et al. 2010). بر خلاف نتایج به دست آمده در این مطالعه، در تعداد کمی از مطالعات قبلی، در گروههای درمانی مختلف هیچ تغییری مشاهده نشد (Denli et al, 2003, Garcia et al2007, Isabel and Santos 2009). بالاترین وزن نسبی کبد (P<0.05) در گروه S0.5 مشاهده شد و در همه گروههایی که اسیدهای آلی به غذای آنها افزوده شد در مقایسه با گروه کنترل بالاتر بود. هیچ تغییر قابل ملاحظهای (P>0.05) در وزن نسبی روده کوچک در اثر افزودن ارگانیک اسیدها مشاهده نشد، که با نتایج حاصل از مطالعات قبلی Gunal و همکاران (۲۰۰۶ ) و Abdel-Fattah و همکاران (۲۰۰۸) مغایرت داشت.
نتایج مثبت مشاهده شده تا حدودی میتواند به فلور میکروبی مفیدتر در دستگاه گوارش و هضم کاملتر غذا نسبت داده شود. در مطالعه حاضر، در گروه S0.5 لاکتوباسیل و اشرشیاکلی به ترتیب بالاتر(P<0.05) و پایینتر (P<0.05) بودند (جدول ۲). به علاوه، تعداد لاکتوباسیلها در سایر گروههای تحت درمان به غیر از S0.3 در مقایسه با گروه کنترل تفاوت قابل توجهی نداشت (P>0.05). پایینترین pH دوازدهه در گروههای P0.3، P0.5 و S0.5 مشاهده شد، هرچند تغییر قابل ملاحظهای در بین گروهها وجود نداشت (جدول ۲). تغییرات در محیط روده میتواند علت بهبود قابلیت رشد و خصوصیات لاشه باشد. تغییرات در فلور میکروبی میتواند باعث کاهش رقابت میکروبی میزبان برای مواد غذایی و کارکرد بهتر موکوس شود، بنابراین باقی ماندن مواد غذایی بیشتر برای جذب و بهبود قابلیت جذب موکوسی ایجاد میشود. بهعلاوه، همانطور که در مطالعه Garcia و همکاران (۲۰۰۷) و Khodambashi و همکاران (۲۰۱۳) مشاهده شد، pH کاهش یافته دوازدهه باعث حلالیت بیشتر و هضم کاملتر مواد غذایی میشود.
این تأثیرات میتواند غلظت بالاتر کلسیم در پلاسمای جوجههای تغذیه شده با افزودنیها را توضیح دهد (جدول ۳). در همین رابطه، Hernandez و همکاران (۲۰۰۶) هیچ تفاوتی بین pH ژژونوم گروه تغذیه شده با مواد افزودنی و کنترل مشاهده ننمودند. از طرفی، این موضوع که گروه S0.5 اثر مشهودتری روی pH و فلور میکروبی روده دارد، میتواند نشان دهنده بهبود کارکرد دستگاه گوارش در نتیجه مقادیر متفاوت pKa اسید فرمیک و اسید پروپیونیک و نمک آنها باشد. انتظار میرود که مخلوط اسیدهای آلی با مقادیر متفاوت pKa اثر گستردهای در دستگاه گوارش داشته باشد (Van Immerseel et al. 2006)، که در این صورت مقادیر افزایش یافته pH در حرکت خوراک به سمت قسمتهای پایینی گوارش مشاهده میشود (Gabriel et al. 2006).
کاهش اثرات افزودن اسیدهای آلی بر متابولیتهای پلاسما (جدول ۳)، مطابق نتایج حاصل از مطالعات Hernandez و همکاران (۲۰۰۶) و به جز کلسترول LDL مطابق مطالعه خسروی و همکاران است (۲۰۰۸). این نکته قابل توجه است که افزایش قابل انتظار در هضم و جذب مواد غذایی ناشی از افزودن اسیدهای آلی در مطالعه حاضر هیچ تأثیری بر متابولیتهای پلاسما نداشت. هرچند، این نکته که وزن نسبی کبد در گروه S0.5 بالاتر (P<0.05) بود و در سایر گروههایی که افزودنی دریافت کرده بودند در مقایسه با گروه کنترل نیز بالاتر بود (جدول ۲) که نشانگر افزایش فعالیت لیپوژنتیک است (Aletor et al, 2000) که ممکن است در اثر افزایش سوبسترای موجود ایجاد شده باشد.
اثرات افزودن اسیدهای آلی به جیره بر پاسخ ایمنی بر علیه واکسنها وSRBC در جدول ۴ نشان داده شده است. تغییر خاصی در پاسخ به واکسنها در اثر افزودن اسیدهای آلی مشاهده نشد. پاسخ به بیماری نیوکاسل در گروههای F0.5، S0.3 و S0.5 در ۴۲ روزگی پایدارتر (P<0.05 بود.
در گروههای دریافت کننده افزودنی هیچ اثر مثبتی در پاسخ به بیماری گامبورو در مقایسه با گروه کنترل مشاهده نشد. گروه P0.5 بالاترین پاسخ آنتیبادی (P<0.05) به برونشیت عفونی را نشان داد و در همه گروههای دریافت کننده افزودنی پاسخ بالاتری نسبت به گروه کنترل مشاهده شد. در مورد SRBC، بالاترین پاسخ در ۲۸ و ۴۲روزگی در گروههای F0.5، P0.5 و S0.5 مشاهده شد. پاسخ Ig کلی در گروههای F0.5، P0.5 و S0.5 در ۲۸ روزگی و در F0.5 و S0.5 در ۴۲ روزگی بالاتر (P<0.05) بود. بالاترین (P<0.05) پاسخ IgG در ۴۲ روزگی در گروه S0.5 مشاهده شد، در حالی که هیچ تفاوت قابل ملاحظهای (P>0.05) بین گروههای دریافت کننده افزودنی در ۲۸ روزگی مشاهده نشد. پاسخ IgM در ۲۸ و ۴۲ روزگی به ترتیب در گروههای P0.5 و F0.5 در بالاترین مقدار(P<0.05) بودند. هم چنین، در گروه F0.5 در ۲۸ روزگی و در گروه P0.5 و S0.5در ۴۲ روزگی بالاتر(P<0.05) از گروه کنترل بود. مطالعات قبلی نتایج متضادی از افزودن اسیدهای آلی بر پاسخ ایمنی جوجههای گوشتی نشان دادهاند. خسروی و همکاران (۲۰۱۰) هیچ تفاوتی در تعداد سلولهای ایمنی جوجههای گوشتی که به جیره آنها ۲/۰٪ اسید پروپیونیک افزوده شده بود، مشاهده ننمودند. سایر محققین، پاسخ ایمنی بالاتری پس از افزودن ۲/۰٪ از مخلوط تجاری اسیدفرمیک و اسیدپروپیونیک و نمک آمونیومی آنها (خدامباشی و همکاران ۲۰۱۳) یا ۲/۰٪ اسید سیتریک گزارش نمودهاند (Rahmani and Speer 2005). بهبود پاسخ ایمنی جوجههای گوشتی در اثر افزودن اسیدهای آلی در مطالعه حاضر، ممکن است در ارتباط با افزایش مشاهده شده در تعداد لاکتوباسیلهای دستگاه گوارش باشد، از آن جایی که این باکتریها اثرات سودمندی بر دستگاه گوارش میزبان دارند (Xue et al, 2003).
در مجموع، افزودن ۵/۰٪ از اسید فرمیک یا پروپیونیک اسید یا مخلوط تجاری (سالگارد) آنها حاوی هردو اسید به همراه نمک آمونیومی آنها به طور مشخصی قابلیت رشد، خصوصیات لاشه، تیتر آنتیبادی نسبت به برونشیت عفونی و SRBC در مقایسه با گروه کنترل یا ۳/۰٪ افزودنی را بهبود بخشید. در کل، نتایج این مطالعه حاکی از این است که مخلوط تجاری اسیدهای آلی
تاثیرات افزودن مقادیر افزایش یافته اسیدهای آلی بر قابلیت رشد، خصوصیات لاشه، pH و فلور طبیعی روده، متابولیتهای پلاسما و پاسخ ایمنی در جوجههای گوشتی
روزبه فتحی۱، محمد صالح صمدی۱، علی قطبی۱، علیرضا صیداوی، Andres L. Martines Marin2
۱ دانشگاه آزاد اسلامی، واحد رشت، گروه علوم دامی
۲ دانشگاه Cordoba، گروه تولید دامی
تأثیرات افزودن مقادیر افزایشیافته اسیدهای آلی بر قابلیت رشد، خصوصیات لاشه، pH و فلور طبیعی روده، متابولیتهای پلاسما و پاسخ ایمنی در جوجههای گوشتی مورد مطالعه قرار گرفت. ۲۱۰ جوجه یک روزه ماده از نژاد Cobb 500 با یکی از درمانهای زیر مورد مطالعه قرار گرفتند (سه گروه ۱۰ پرندهای برای هر درمان). کنترل (جیره پایه بدون اسید افزوده شده)، جیره پایه با ۳/۰ و ۵/۰ درصد فرمیک اسید افزوده شده (گروه های F0.3 و F0.5)، پروپیونیک اسید (گروه های P0.3 و P0.5) و یا یک مخلوط تجاری از هر دو اسید و نمک آمونیوم آنها (گروه های S0.3 و S0.5). گروههای F0.5، P0.5 و S0.5 بهترین نتایج را در وزن بدن، ضریب تبدیل و وزن نسبی سینه و ران نشان دادند. S0.5 بیشترین وزن نسبی کبد و بالاترین تعداد لاکتوباسیل و کمترین تعداد اشرشیاکلی را داشت. پایینترین pH دوازدهه در گروه های P0.3 و P0.5 مشاهده شد. کلسیم پلاسما در گروههایی که افزودنی دریافت کرده بودند، بالاتر بود. پاسخ ایمنی به بیماری نیوکسل در گروههای F0.5، S0.3 و S0.5 پایدارتر بود. گروههایی که افزودنی دریافت کرده بودند، پاسخ بهتری به برونشیت عفونی داشتند، در حالی که پاسخ به SRBC در F0.5، P0.5 و S0.5 بالاتر بود. افزودن اسید فرمیک یا اسیدپروپیونیک ۵/۰ درصد به جیره جوجه گوشتی اثر مثبت بر قابلیت تولیدی طیور داشت، اما مخلوط هر دو اسید با نمکهایشان کارآمدتر بود. تغییر در محیط روده ناشی از افزودن ارگانیک اسیدها میتواند موجب دسترسی افزایش یافته به مواد مغذی و پاسخ ایمنی بهبود یافته میشود.
کلمات کلیدی: اسید فرمیک، اسید پروپیونیک، طیور، تولید، هضم، ایمنی
چندین ماده در سالهای اخیر با هدف یافتن جایگزین برای آنتیمیکروبهای محرک رشد مورد بررسی قرار گرفتند که قادر به حمایت از قابلیت رشد و جلوگیری از وقوع برخی بیماریها در طیور هستند (Huyghebaert et al. 2011). در بین این مواد، اسیدهای آلی و نمک آنها مورد توجه بیشتری قرار گرفتند، زیرا علاوه بر خواص ضد میکروبی، مزایایی نسبت به ویژگیهای آنتیبیوتیکها نشانداده که تولید را در طیور بالا میبرد (Dibner and Buttin 2002).
اثرات آنتیمیکروبیال اسیدهای آلی با توانایی عبور آن از غشای سلولی، جدا شدن آن در محیط آلکالینی داخل سلولی و توانایی اسیدی کردن سیتوپلاسم توضیح داده شده است. بنابراین، pH پایین در روده یا pKa بالاتر اسید کارآیی آنتیمیکروبیال اسیدهای آلی را افزایش میدهد (Van Immersal et al. 2006). برخی دیگر از اثرات توصیف شده در مورد اسیدهای آلی شامل بهبود هضم و جذب برخی مواد مغذی ناشی از pH پایینتر هضم و قابلیت حل شدن بالاتر اجزای جیره است (Brenes et al. 2003, Rafacz-Livingston et al. 2005, Ao et al, 2009). بهبود جمعیت میکروبی طبیعی در روده با کاهش چسبندگی باکتریهای پاتوژن و کمک به حفظ فلور طبیعی روده باعث بهبود شکل بافتی روده (Choct 2009) و پاسخ ایمنی بهینه میشود (Brisbin et al. 2008, Gabriel et al. 2006, Lan et al. 2005) و اثر تغذیهای مستقیم بر موکوس گوارش دارد، زیرا میتواند به عنوان منبع انرژی با قابلیت جذب سریع برای سلولهای روده عمل کند (Sakata 1987).
در سالهای اخیر، چندین محقق اثرات افزودن اسید فرمیک و اسید پروپیونیک و نمک آنها به جیره غذایی طیور گوشتی را به تنهایی (García et al. 2007, Hernández et al. 2006, Khosravi et al. 2012) یا در ترکیب (Gunal et al. 2006, Isabel and Santos 2009, Khodambashi et al. 2013) بر کارایی رشد و خصوصیات لاشه بررسی نمودهاند، اما نتایج متناقض بودهاند. به علاوه، مطالعات همزمان که اثرات این اسیدها در مقادیر مختلف را مورد مقایسه قرار دهند، نادر است. همچنین، تعداد کمی از محققین گزارشاتی مبنی بر متابولیتهای پلاسما یا پاسخ ایمنی در جوجههای گوشتی پس از افزودن این مواد ارائه دادهاند.
هدف از مطالعه حاضر، بررسی اثرات افزودن دو سطح از اسید فرمیک، اسید پروپیونیک و یک مخلوط تجاری از هر دو اسید و نمکهای آمونیوم آنها بر قابلیت رشد، خصوصیات لاشه، pH دوازدهه، فلور طبیعی روده، متابولیتهای پلاسما و پاسخ ایمنی در جوجههای گوشتی است.
مواد و روش ها
حیوانات، محل نگهداری، جیره غذایی و درمان
استفاده و مراقبت از پرندهها و کل فرآیندها در این مطالعه مورد تأیید کمیته اخلاق دانشگاه آزاد اسلامی قرار گرفته است. ۲۱۰ جوجه یک روزه ماده از نژاد Cobb 500 (Cobb-Vantress Inc., Siloam Springs, AR) خریداری شده از یک مرکز تجاری، مورد استفاده قرار گرفتند. جوجههای گوشتی در قفس های ۱×۱ متر که کف آنها با کاغذ مخصوص پوشانده شده، نگهداری شدند. هر قفس با یک دانخوری بشقابی و آبخوری دستی مجهز شد. امکانات شامل یک فضای باز مجهز به پردهها و هیترهای گازوئیلی با قابلیت تنظیم دما، مه پاش، فن و لامپهای فلورسنت است. دما روی ۳۲ درجه تنظیم شد و به تدریج به ۲۴ درجه در طی ۳ هفته کاهش یافت. غذا و آب در طی مطالعه در دسترس بود.
کل مطالعه ۴۲ روزبه طول انجامید. برنامه غذایی به این نحو بود که جوجهها تا ۷ روزگی با استارتر تغذیه شدند (دوره شروع)، پس از آن تا ۲۱ روزگی با grower تغذیه شدند (دوره رشد) و پس از آن تا پایان دوره (دوره finishing) با یک رژیم finishing تغذیه شدند. همه خوراکها بر پایه ذرت-سویا بودند و هیچ آنتیبیوتیکی به خوراک افزوده نشد. فرمول جیره بر اساس توصیههای کاتالوگ پرورش سوش کاب ۵۰۰ تنظیم شد (جدول ۱). جوجهها تحت یکی از درمانهای زیر قرار گرفتند: کنترل (جیره پایه بدون اسیدهای آلی)، همین جیره پایه همراه با ۳/۰ و ۵/۰ درصد فرمیک اسید (گروه های F0.3 و F0.5) ، ۳/۰ و ۵/۰ درصد پروپیونیک اسید ( گروه های P0.3 و P0.5) و سالگارد (S0.3 و S0.5).
سالگارد (Optivite, Worksop, UK) حاوی مخلوطی از اسید فرمیک و اسید پروپیونیک و نمکهای آمونیومی آنها است. هر گروه ۳ تکرار داشت. ۲۱ گروه ۱۰ پرندهای با هم در یک قفس بودند.
قابلیت رشد و خصوصیات لاشه
وزن بدن (BW) جوجه و مصرف غذا، هر هفته ثبت گردید و وزن افزوده شده (BWG, g/period)، دریافت غذا (F1, g/period) و ضریب تبدیل غذا (FCR, feed to gain g/g) تعیین شد. در سن ۴۲ روزگی، پس از ۴ ساعت عدم مصرف غذا برای اطمینان از خالی بودن رودهها، ۳ جوجه از هر گروه که به وزن مناسبی رسیده بودند، برای تعیین خصوصیات لاشه یوتانیزه شدند. وزن عضلات سینه و ران، بالها، کبد و صفرا و روده کوچک ثبت گردید.
شمارش میکروبی و اندازهگیری pH دوازدهه
در سن ۴۲ روزگی، ۳ جوجه در هر گروه انتخاب و یوتانایز شدند. سکوم هر جوجه یوتانایز شده سریعاً جدا و محتوای آن در یک لوله استریل جمعآوری شد. از این محتوا، رقتهای متوالی ۱۰ برابری از یک گرم نمونه در محلول بافری فسفات تهیه شد (تا ). سپس ۱۰۰ میکرولیتر از رقتهای سریالی برداشت شد و در پتریدیشهای حاوی محیط کشت ریخته شد. لاکتوباسیل در De Man، Rosoga, و Sharpe agar کشت داده شد و در ۳۷ درجه تحت شرایط بیهوازی به مدت ۷۲ ساعت کشت داده شد. اشرشیاکلی در محیط ائوزین متیلن بلوآگار کشت داده شد و تحت شرایط بیهوازی در دمای ۳۷ درجه به مدت ۴۸ ساعت انکوبه شد. واحدهای تشکیل دهنده کلونی باکتریای (CFU ) در پتریدیشها شمارش شد. شمارش به صورت log 10 CFU به ازای یک گرم نمونه گزارش شد. برای اندازهگیری pH دوازدهه، همین تعداد از حیوانات انتخاب و یوتانیزه شدند. محتوای دوازدهه به آرامی خارج شد و در ۱۰ میلی لیتر آب دیونیزه رقیق شد. سپس، pH توسط pH متر اندازه گیری شد.
جمعآوری خون و آنالیز و مطالعه پاسخ ایمنی
برای اندازهگیری متابولیتها و مواد معدنی پلاسما در سن ۴۲ روزگی، ۳ جوجه از هر گروه انتخاب شدند و نمونه خون از رگهای بال، در لوله حاوی EDTA جمع آوری شد. پس از سانتریفوژ نمونههای خونی (۳۰۰۰ دور در دقیقه به مدت ۱۰ دقیقه در دمای اتاق)، پلاسما در تیوبهای اپندورف در دمای ۲۰- درجه تا زمان ارزیابی نگهداری شد. آنالیز بیوشیمیایی مطابق پروتکلهای استاندارد کیتهای آزمایشگاهی تجاری (Pars Azmoon) انجام شد. پارامترهای اندازهگیری شده شامل گلوگز، پروتئین، آلبومین، اوریک اسید، تری گلیسیرید، کلسترول، کلسیم و فسفر بودند.
تولید آنتیبادی به آنتیژنهای مختلف در طول آزمایش اندازهگیری شد. ابتدا پرندهها بر علیه برونشیت عفونی (در ۱۴ و ۱۷ روزگی)، نیوکاسل (۹، ۲۰ و ۳۰ روزگی)، آنفولانزا (یک روزگی) و گامبورو (۱۴ و ۲۳ روزگی) واکسینه شدند. همه واکسنها از موسسه رازی تهران تهیه شدند. به علاوه، یک پرنده از هر گروه در زیر پوست سینه با ۵/۰ میلی لیتر از سوسپانسیون ۱۰٪ گلبول قرمز گوسفندی در بافر نمکی فسفات (SRBC) در سن ۲۱ و ۳۵ روزگی مورد تزریق قرار گرفت. برای اندازهگیری پاسخ آنتی بادی سیستمیک، نمونههای خونی از هر جوجه از هر گروه از رگ خونی بال در روزهای ۲۱، ۳۵ و ۴۲ روزگی (نیوکاسل)، در ۴۲ روزگی (برونشیت عفونی و گامبورو) و در ۲۸ و ۴۲ روزگی (SRBC) جمعآوری شد. پاسخ آنتیبادی به برونشیت عفونی و بیماری گامبورو توسط کیتهای تجاری الایزا اندازهگیری شد. تیتر کلی Ig و Ig G در پاسخ به SRBC توسط تست hemagglutination اندازهگیری شد. تیتر IgM به SRBC با محاسبه اختلاف بین تیتر Ig کلی و IgG تعیین شد.
نتایج و بحث
در مقایسه با گروه کنترل، BWG در گروههای F0.5، P0.3، P0.5، S0.3 و S0.5 (جدول ۲) بالاتر بود (P<0.05). به غیر از P0.3 بقیه گروهها FCR بهتری نسبت به گروه کنترل داشتند. با در نظر گرفتن خصوصیات لاشه، گروههای F0.5، P0.5، S0.3 و S0.5 نسبت به گروه کنترل BW بالاتری (P<0.05) داشتند (جدول ۲). به طور واضح، بهترین نتایج در گروههای F0.5، P0.5 و S0.5 مشاهده شد. هرچند نتایج ارائه شده در مقالات، یکسان نیستند. برخی از نویسندگان، قابلیت رشد بهبود یافتهای در جوجههای گوشتی وقتی با جیرهای که با سطوح مختلفی از اسید فرمیک و اسید پروپیونیک یا مخلوط این دو تغذیه میشوند، گزارش دادهاند ((Garcia et al, 2007K, Khodambashi et al, 2013, Paul et al, 2007. هرچند، چندین نویسنده هیچ بهبودی در ارتباط با این مواد گزارش ننمودهاند (Hernandez et al. 2006, Isabel and Santos 2009, Khosravi et al. 2010). بر خلاف نتایج به دست آمده در این مطالعه، در تعداد کمی از مطالعات قبلی، در گروههای درمانی مختلف هیچ تغییری مشاهده نشد (Denli et al, 2003, Garcia et al2007, Isabel and Santos 2009). بالاترین وزن نسبی کبد (P<0.05) در گروه S0.5 مشاهده شد و در همه گروههایی که اسیدهای آلی به غذای آنها افزوده شد در مقایسه با گروه کنترل بالاتر بود. هیچ تغییر قابل ملاحظهای (P>0.05) در وزن نسبی روده کوچک در اثر افزودن ارگانیک اسیدها مشاهده نشد، که با نتایج حاصل از مطالعات قبلی Gunal و همکاران (۲۰۰۶ ) و Abdel-Fattah و همکاران (۲۰۰۸) مغایرت داشت.
نتایج مثبت مشاهده شده تا حدودی میتواند به فلور میکروبی مفیدتر در دستگاه گوارش و هضم کاملتر غذا نسبت داده شود. در مطالعه حاضر، در گروه S0.5 لاکتوباسیل و اشرشیاکلی به ترتیب بالاتر(P<0.05) و پایینتر (P<0.05) بودند (جدول ۲). به علاوه، تعداد لاکتوباسیلها در سایر گروههای تحت درمان به غیر از S0.3 در مقایسه با گروه کنترل تفاوت قابل توجهی نداشت (P>0.05). پایینترین pH دوازدهه در گروههای P0.3، P0.5 و S0.5 مشاهده شد، هرچند تغییر قابل ملاحظهای در بین گروهها وجود نداشت (جدول ۲). تغییرات در محیط روده میتواند علت بهبود قابلیت رشد و خصوصیات لاشه باشد. تغییرات در فلور میکروبی میتواند باعث کاهش رقابت میکروبی میزبان برای مواد غذایی و کارکرد بهتر موکوس شود، بنابراین باقی ماندن مواد غذایی بیشتر برای جذب و بهبود قابلیت جذب موکوسی ایجاد میشود. بهعلاوه، همانطور که در مطالعه Garcia و همکاران (۲۰۰۷) و Khodambashi و همکاران (۲۰۱۳) مشاهده شد، pH کاهش یافته دوازدهه باعث حلالیت بیشتر و هضم کاملتر مواد غذایی میشود.
این تأثیرات میتواند غلظت بالاتر کلسیم در پلاسمای جوجههای تغذیه شده با افزودنیها را توضیح دهد (جدول ۳). در همین رابطه، Hernandez و همکاران (۲۰۰۶) هیچ تفاوتی بین pH ژژونوم گروه تغذیه شده با مواد افزودنی و کنترل مشاهده ننمودند. از طرفی، این موضوع که گروه S0.5 اثر مشهودتری روی pH و فلور میکروبی روده دارد، میتواند نشان دهنده بهبود کارکرد دستگاه گوارش در نتیجه مقادیر متفاوت pKa اسید فرمیک و اسید پروپیونیک و نمک آنها باشد. انتظار میرود که مخلوط اسیدهای آلی با مقادیر متفاوت pKa اثر گستردهای در دستگاه گوارش داشته باشد (Van Immerseel et al. 2006)، که در این صورت مقادیر افزایش یافته pH در حرکت خوراک به سمت قسمتهای پایینی گوارش مشاهده میشود (Gabriel et al. 2006).
کاهش اثرات افزودن اسیدهای آلی بر متابولیتهای پلاسما (جدول ۳)، مطابق نتایج حاصل از مطالعات Hernandez و همکاران (۲۰۰۶) و به جز کلسترول LDL مطابق مطالعه خسروی و همکاران است (۲۰۰۸). این نکته قابل توجه است که افزایش قابل انتظار در هضم و جذب مواد غذایی ناشی از افزودن اسیدهای آلی در مطالعه حاضر هیچ تأثیری بر متابولیتهای پلاسما نداشت. هرچند، این نکته که وزن نسبی کبد در گروه S0.5 بالاتر (P<0.05) بود و در سایر گروههایی که افزودنی دریافت کرده بودند در مقایسه با گروه کنترل نیز بالاتر بود (جدول ۲) که نشانگر افزایش فعالیت لیپوژنتیک است (Aletor et al, 2000) که ممکن است در اثر افزایش سوبسترای موجود ایجاد شده باشد.
اثرات افزودن اسیدهای آلی به جیره بر پاسخ ایمنی بر علیه واکسنها وSRBC در جدول ۴ نشان داده شده است. تغییر خاصی در پاسخ به واکسنها در اثر افزودن اسیدهای آلی مشاهده نشد. پاسخ به بیماری نیوکاسل در گروههای F0.5، S0.3 و S0.5 در ۴۲ روزگی پایدارتر (P<0.05 بود.
در گروههای دریافت کننده افزودنی هیچ اثر مثبتی در پاسخ به بیماری گامبورو در مقایسه با گروه کنترل مشاهده نشد. گروه P0.5 بالاترین پاسخ آنتیبادی (P<0.05) به برونشیت عفونی را نشان داد و در همه گروههای دریافت کننده افزودنی پاسخ بالاتری نسبت به گروه کنترل مشاهده شد. در مورد SRBC، بالاترین پاسخ در ۲۸ و ۴۲روزگی در گروههای F0.5، P0.5 و S0.5 مشاهده شد. پاسخ Ig کلی در گروههای F0.5، P0.5 و S0.5 در ۲۸ روزگی و در F0.5 و S0.5 در ۴۲ روزگی بالاتر (P<0.05) بود. بالاترین (P<0.05) پاسخ IgG در ۴۲ روزگی در گروه S0.5 مشاهده شد، در حالی که هیچ تفاوت قابل ملاحظهای (P>0.05) بین گروههای دریافت کننده افزودنی در ۲۸ روزگی مشاهده نشد. پاسخ IgM در ۲۸ و ۴۲ روزگی به ترتیب در گروههای P0.5 و F0.5 در بالاترین مقدار(P<0.05) بودند. هم چنین، در گروه F0.5 در ۲۸ روزگی و در گروه P0.5 و S0.5در ۴۲ روزگی بالاتر(P<0.05) از گروه کنترل بود. مطالعات قبلی نتایج متضادی از افزودن اسیدهای آلی بر پاسخ ایمنی جوجههای گوشتی نشان دادهاند. خسروی و همکاران (۲۰۱۰) هیچ تفاوتی در تعداد سلولهای ایمنی جوجههای گوشتی که به جیره آنها ۲/۰٪ اسید پروپیونیک افزوده شده بود، مشاهده ننمودند. سایر محققین، پاسخ ایمنی بالاتری پس از افزودن ۲/۰٪ از مخلوط تجاری اسیدفرمیک و اسیدپروپیونیک و نمک آمونیومی آنها (خدامباشی و همکاران ۲۰۱۳) یا ۲/۰٪ اسید سیتریک گزارش نمودهاند (Rahmani and Speer 2005). بهبود پاسخ ایمنی جوجههای گوشتی در اثر افزودن اسیدهای آلی در مطالعه حاضر، ممکن است در ارتباط با افزایش مشاهده شده در تعداد لاکتوباسیلهای دستگاه گوارش باشد، از آن جایی که این باکتریها اثرات سودمندی بر دستگاه گوارش میزبان دارند (Xue et al, 2003).
در مجموع، افزودن ۵/۰٪ از اسید فرمیک یا پروپیونیک اسید یا مخلوط تجاری (سالگارد) آنها حاوی هردو اسید به همراه نمک آمونیومی آنها به طور مشخصی قابلیت رشد، خصوصیات لاشه، تیتر آنتیبادی نسبت به برونشیت عفونی و SRBC در مقایسه با گروه کنترل یا ۳/۰٪ افزودنی را بهبود بخشید. در کل، نتایج این مطالعه حاکی از این است که مخلوط تجاری اسیدهای آلی به همراه نمک آنها نتایج بهتری نسبت به اسیدهای آلی جداگانه نشان میدهد. اثرات مشاهده شده احتمالاً در نتیجه چندین اثر مثبت اسیدهای آلی روی دستگاه گوارش مشاهده شدند که مهمترین آنها کاهش pH دئودنوم و تغییرات مطلوب در فلور میکروبی سکوم است که میتواند منجر به افزایش دسترسی مواد غذایی حیوان و بهبود پاسخ ایمنی شود.
به همراه نمک آنها نتایج بهتری نسبت به اسیدهای آلی جداگانه نشان میدهد. اثرات مشاهده شده احتمالاً در نتیجه چندین اثر مثبت اسیدهای آلی روی دستگاه گوارش مشاهده شدند که مهمترین آنها کاهش pH دئودنوم و تغییرات مطلوب در فلور میکروبی سکوم است که میتواند منجر به افزایش دسترسی مواد غذایی حیوان و بهبود پاسخ ایمنی شود.